El 1389 el rei Joan I de Castella atorgà un privilegi per al qual lliura a l'Orde de Sant Jeroni, llavors jove orde monàstic (fundat només quinze anys abans), l'església del santuari de la Mare de Déu de Guadalupe, a la província de Càceres. El santuari era un lloc molt concorregut i popular, meta de pelegrinatges, i les terres del voltant, molt riques. Els monjos, en establir-se, van construir-hi l'edifici monàstic, l'església i tot un seguit de serveis assistencials: escola, hospitals per als pelegrins (on es desenvolupà una prestigiosa escola de medicina), tallers, etc. L'explotació de les terres, dedicades a l'agricultura i, sobretot, a la ramaderia, va fer que el monestir esdevingués aviat un dels més rics de la Corona de Castella, com també el poble que s'hi formà al voltant, la Puebla de Guadalupe. A més, l'orde va revitalitzar els pelegrinatges al santuari, cada cop més nombrosos arran de la fama del monestir i dels serveis que s'hi oferien, especialment l'assistència mèdica: aquests pelegrinatges van ésser una altra important font d'ingressos.

Finalment, durant els segles XV i XVI fou especialment afavorit per l'aristocràcia castellana i pels reis. El 1464, el rei Enric IV de Castella, hi va portar la infanta i futura reina Isabel la Catòlica amb la intenció d'acordar-ne el casament amb Alfons V de Portugal, però la infanta el refusà. Tanmateix, a Isabel la Catòlica li va agradar molt l'indret i el visità amb freqüència, deixant-hi el seu testament original, que s'hi conserva.

Cristòfor Colom també hi va acudir cercant el finançament pels seus viatges a Amèrica (Sentència de Guadalupe).