Neben einigen Teilbibliotheken der Prager Universität entstand im 13. Jahrhundert im dominikanischen Kloster in der Prager Altstadt die Schule Studium generale, die im 14. Jahrhundert samt der Bibliothek mit der Universität verschmolz. Im Jahre 1556 bauten Mönche des Jesuitenordens auf den Resten des Klosters ein Internat, das Clementinum hieß. 1622 kam auch die Karlsuniversität unter die Verwaltung der Jesuiten und alle Bibliotheken wurden im Clementinum untergebracht.

Nach der Aufhebung des Jesuitenordens wurde die Universität 1773 eine staatliche Einrichtung und ihre Bibliothek im Februar 1777 durch Maria Theresia zur „öffentlichen k. k. Universitätsbibliothek“ erklärt. Die Idee stammte vom böhmischen Grafen František Josef Kinský. Er hatte mit der Kaiserin verabredet, dass seine Stammbibliothek und seine Privatbibliothek mit der jesuitischen Bibliothek im Klementinum vereinigt werden sollten. Der Orden hatte sich vier Jahre zuvor aufgelöst. Und hier im Klementinum befanden sich viele Bücher aus den aufgelösten Kollegien in den böhmischen Provinzen. Und die vierte war eine öffentliche Bibliothek im Karolinum. Schließlich wurden diese vier Bibliotheken im Jahr 1777 im Klementinum vereinigt.[1], was sich 1887 auch im Namen der Bibliothek manifestierte (c.k. Veřejná a univerzitní knihovna). Auch nach der Teilung der Universität 1882 in die tschechische Univerzita Karlova (Karls-Universität) und die Deutsche Universität Prag blieb die Bibliothek für beide Universitäten als eine gemeinsame Einrichtung erhalten.

Nach 1918 fiel die Bibliothek unter die Verwaltung der neuen Tschechoslowakei. 1924 wurde die Slovanská knihovna (Slawische Bibliothek) gegründet, die 1929 ebenfalls im Clementinum untergebracht wurde und bis heute autonomer Bestandteil der Nationalbibliothek ist.

1935 wurde die Bibliothek in Národní a univerzitní knihovna (National- und Universitätsbibliothek) umbenannt, gleichzeitig wurde das Gesetz über das Pflichtexemplar erlassen. Nachdem 1939 nach der Besetzung durch die Wehrmacht die tschechischen Hochschulen geschlossen wurden, blieb die Bibliothek unter der Bezeichnung Zemská a univerzitní knihovna (Landes- und Universitätsbibliothek) bis 1941 in Betrieb. 1958 wurden mehrere Bibliotheken in Prag zu einer großen Státní knihovna ČSR (Staatliche Bibliothek der ČSR) zusammengeschlossen. 1990 schließlich erhielt sie den heutigen Namen Národní knihovna (Nationalbibliothek).

Der Bestand der Bibliothek ist im elektronischen Katalog erfasst und kann eingesehen werden.[2][3]