מקורו של המנזר הוא בשלהי המאה ה-13, לאחר שרועה צאן מקסרס גילה על גדת נהר הגואדלופה פסל של המדונה, שככל הנראה הוחבא על ידי התושבים המקומיים מפני הפולשים המורים בשנת 714. באתר שבו התגלה הפסל נבנתה קפלה. הקפלה הפכה לכנסייה מספר שנים לאחר הקמתה, והיא הורחבה פעם נוספת על ידי המלך אלפונסו ה-11, שביקר בקפלה מספר פעמים. אלפונסו עשה זאת כהוקרה על ניצחונו בקרב ריו סלדו, אותו ייחס להתערבותה של המדונה. הוא הכריז על הכנסייה בגואדלופה כאתר קדוש מלכותי, והחל לבצע את תוכניתו לבנות את המקום מחדש.

הנזירים ההיירונימיטים תפסו את השליטה על המנזר ב-1389 והפכו אותו לאתר המרכזי של פעילותם. עבודות הבנייה נמשכו תחת חסותו של ראש המסדר הראשון, וב-1474 נקבר במקום אנריקה הרביעי לצד אמו.

אקסטרמדורה הייתה המקום הראשון שאליו כריסטופר קולומבוס עלה לרגל כדי להודות לאלוהים על שגילה את יבשת אמריקה. המנזר מכיל חפצים רבים הקשורים לעולם החדש, ומבנים רבים הוקמו שם לכבוד הבתולה מגואדלופה, בהם בזיליקת גואדלופה המקסיקנית.

החסות המלכותית נותרה על כנה גם לאחר שנזירים מגואדלופה הקימו את מנזר אל אסקוריאל המפורסם, שהיה קרוב יותר לעיר הבירה המלכותית מדריד. המנזר נחשב לאחד הקלויסטרים החשובים ביותר בספרד עד לחילון המנזרים ב-1835. בעקבות חילון המנזרים הועבר המנזר לבעלותה של ארכידיוקסיית טולדו, שהעבירה אותו ב-1908 לבעלותו של המסדר הפרנציסקני. במהלך המאה ה-20 שוקם המנזר על ידי המסדר, והאפיפיור פיוס ה-12 העניק לו מעמד של "בזיליקה אפיפיורית קטנה" ב-1955.

מחוץ למנזר, במזרקה שבמורד המדרגות, הוטבל לנצרות אברהם שניור קורונל, שר האוצר של המלכים הקתולים בשנת 1492, אחיו ושלושה יהודים נוספים. הסנדקים בטקס היו המלכים הקתולים.