Bazylika została zbudowana przy Via Ostiense przez cesarzy Teodozjusza I, jego syna Arkadiusza i Walentyniana II w latach 386-440. Pięcionawowa budowla poprzedzona została atrium. Zbudowano ją w miejscu, gdzie wcześniej Lucyna Rzymska pochowała ciało św. Pawła (on sam został ścięty około 3 km od tego miejsca. Zgodnie z legendą, jego głowa trzykrotnie odbiła się od ziemi, z której wytrysnęły trzy źródła wody). Nad grobem św. Pawła zbudowana została najpierw niewielka kapliczka, która przetrwała do czasu zbudowania bazyliki. Starożytną bazylikę poświęcił w 390 roku papież Syrycjusz. 15 lipca 1823, podczas prowadzenia prac dekarskich został zaprószony ogień. Pożar zniszczył prawie całą bazylikę. Podjęto odbudowę, starając się zachować pierwotny kształt świątyni. Zakończenie prac i ponowne poświęcenie bazyliki nastąpiło w 1854.