Quitos historia går tillbaka till det första årtusendet då nomadiska stammar flyttade till området och byggde ett kommersiellt centrum i Quitos nuvarande läge. Tidigt under 1500-talet erövrade Inkafolket staden, med förhoppningen att utöka sitt kungadöme, men när spanjorerna anlände 1533 övergavs planerna. Rumiñahui, en inkageneral, brände staden för att förhindra spanjorerna från att överta den och förstörde därmed spåren av den förspanska staden.

De inföddas motstånd under den spanska erövringen fortsatte under 1534, då Francisco Pizarro den 15 augusti grundade San Francisco de Quito. 6 december 1534,[1] grundades staden officiellt av 204 bosättare och Sebastián de Belalcázar, som besegrade Rumiñahui och avslutade det organiserade motståndet. Rumiñahui avrättades 10 januari 1535. Den 14 mars 1541, utnämndes Quito till stad och 14 februari 1556 fick staden titeln Muy Noble y Muy Leal Ciudad de San Francisco de Quito ("Den mycket nobla och lojala staden San Francisco de Quito").

Spanjorerna etablerade snabbt den katolska religionen i Quito, med det första templet, El Belén, som byggdes innan staden officiellt hade grundats. I januari 1535 byggdes San Francisco-klostret, det första av 20 kyrkor och kloster som byggdes under koloniseringsperioden. Spanjorerna missionerade bland infödingarna, men de använde dem även som gratis byggarbetskraft, framför allt under den inledande perioden. Quitos biskopsdöme grundades 1545 och utvidgades till Quitos ärkestift 1849.

1809, efter nära 300 år av spansk kolonisering, hade Quito omkring 10 000 invånare. 10 augusti 1809 startades en rörelse som arbetade för politiskt oberoende av Spanien. Samma dag skapades en regeringsplan som hade Juan Pío Montúfar som president och andra framstående personer på ledande befattningar. Denna rörelse slogs dock tillbaka 20 augusti 1810, när spanska styrkor kom från Lima i Peru och dödade ledarna för upproret tillsammans med ytterligare 200 invånare i staden. En våg av konflikter avslutades 24 maj 1822, när Antonio José de Sucre, under Simón Bolívars befäl, ledde trupperna under slaget vid Pichincha. Deras seger innebar oberoende för Quito och de närliggande områdena.

Bara några dagar efter slaget vid Pichincha, proklamerade stadens ledare oberoendet och tillät staden att införlivas med republiken Storcolombia. Simón Bolívar var närvarande vid undertecknandet av den colombianska konstitutionen 24 juni 1822.