1534 yılında yerli halkın İspanya'ya karşı direnişi devam ederken, 15 Ağustos günü Francisco Pizarro San Francisco de Quito'yu kurdu. 6 Aralık 1534'te şehir, Rumiñahui'yı yakalayan ve organize bütün direnişleri sona erdiren Sebastián de Benalcázar önderliğindeki 204 yerleşimci tarafından resmen kuruldu. Rumiñahui daha sonra 10 Ocak 1535'te idam edildi. 14 Mart 1541'de şehir olduğu ilan edildi ve 14 Şubat 1556'da Muy Noble y Muy Leal Ciudad de San Francisco de Quito (Çok Asil ve Sadık San Francisco Kito Şehri) adı verildi.

İspanyollar acilen Kito'ya daha resmi olarak kurulmasından çok önce kilise yaparak Katoliklik'i yerleştirdiler. 1535 Ocağında San Francisco Manastırı inşa edildi ve ilk 20 kilise ve manastır sömürge döneminde inşa edildi. İspanyollar, etkin bir şekilde yerli halka İncil'i öğrettiler, fakat onları özellikle ilk sömürge dönemlerinde, inşaat işlerinde köle olarak kullandılar. 1545'te Kito Piskoposluk Bölgesi kuruldu ve 1849 yılında Kito Başpiskoposluk Bölgesi'ne yükseltildi.

1809 yılında, yaklaşık 300 yıllık İspanya sömürgesinden sonra, Kito yaklaşık 10,000 yerleşimcinin yaşadığı bir şehirdi. 10 Ağustos 1809'da İspanya'dan bağımsızlığı kazanmak için bir hareketlilik başladı. O gün, hükûmet için bir plan hazırlandı. Juan Pío Montúfar başkan olurken, diğer önemli insanlar hükûmette değişik pozisyonlara geldi. 2 Ağustos 1810 yılında bu ilk hareket, İspanyol askerlerinin Lima, Peru'dan gelip ayaklanmanın öncü liderleriyle birlikte yaklaşık 200 yerleşimcinin öldürülmesiyle yenilgiye uğradı.