Klostret grundades 1345 av ett av de mest vördade ryska helgonen, Sergius av Radonezj, som byggde en träkyrka till den heliga Treenigheten på Makovetskullen. Första utvecklingen av munkkommuniteten är väldokumenterad i samtidens Sergius och hans anhängares liv.

 Sergius av Radonezj välsignar Dmitrij Donskoj före Slaget vid Kulikovo.

År 1355 skrev Sergius en stiftelseurkund vilken krävde byggandet av flera byggnader, såsom refektorium, kök och bageri. Denna urkund var modell för Sergius många efterföljare som grundade fler än 400 kloster över hela Ryssland, däribland de kända Solovetskijklostret, Kirillo-Belozerskijs kloster och Simonovklostret.

Sankt Sergius stödde Dmitrij Donskoj i hans kamp mot tatarerna och skickade två av sina munkar Peresvet och Osljabja, att delta vid Slaget vid Kulikovo (1380). Vid slagets utbrott dog Peresvet i en strid mot en tatarisk bogatyr. Klostret skadades i en brand, då en tatarisk enhet plundrade området 1408.